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  Genética de Procariotas  
 
   
   

    Sumários das Teóricas PDF até 19 Out 06
                                                       PDF até 23 Nov 06

    Protocolos das práticas

   Seminários de Genética de Procariotas (grupos e temas)

Protocolos de práticas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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GENÉTICA DE PROCARIOTAS

Secção de Genética e Dinâmica de Populações

Departamento de Biologia Vegetal

Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa

Maria da Graça Alves Vieira

2006 / 2007

 

ANÁLISE BIOQUÍMICA DE MUTANTES Ara

Estirpes utilizadas Bacillus subtilis HP4, HP7, HP8 e HP24 Ara - met B10 lis3
B. subtilis 168 (controlo)

1ª Aula

A - Verificação dos genótipos das estirpes dadoras e receptoras

B - Análise bioquímica dos mutantes Ara -

C - Determinação da concentração de L-ribulose pelo método da cisteína-carbazólio

Material necessário : Spectronic; culturas das estirpes mutantes e de BR151 em meio TBAB e em meio líquido (C + 0,5%CH); balões erlen-meyer, tubos spectronic, tubos de vidro, caixas de petri de plástico, pipetas de vidro de 5, 10, e 20ml, pró-pipeta, pipetas de precisão (1000 m l, 200 m l, 20 m l) e pontas. Meio C (sólido e líquido), cisteína-HCl (1,5%), H 2 SO 4 (70%), carbazólio (0,12%), D-ribulose-o-nitrofenilhidrazona (a1 m M/ml) diluída em HCL 0,1N , glucose, arabinose, CH, ribitol, aminoácidos.

A
1 .- Preparar caixas de petri com os meios selectivos necessários para a verificação dos genótipos das estirpes dadoras (Ara - ) e receptoras (Ara + ).
2 .- Inocular nos diferentes meios selectivos, por riscado, as diferentes estirpes utilizadas neste trabalho.

B
Inocular, por streaking, os mutantes Ara - e a estirpe BR151 ( met B10 lis 3 trp C2) nos seguintes meios mínimos sólidos
a) Meio C + 0,1% glucose; Meio C + 0,1% arabinose
b) Meio C + 1% caseína hidrolisada (CH); Meio C + 1% CH + 0,1% arabinose
c) Meio C + 0,5% CH + 1% ribitol; Meio C + 0,5% CH + 1% ribitol + 0,1% arabinose

Analisar os resultados 72 horas depois

C
1. Incubadar as culturas durante a noite em meio líquido C + 0,1% CH + 0,1% arabinose a 37 0 C, com agitação.
2. Adicionar 50 m l de cada cultura e do meio de cultura a 450 m l de HCL 0,1N em tubos de ensaio com rolha de algodão.
3. Juntar pela ordem indicada:

Cisteína-HCL a 1,5% (solução preparada na altura) 0,1ml
H2SO4 a 70% 3,0ml
Carbazólio (solução alcoólica) a 0,12% 0,1ml
Agitar imediatamente no vortex, deixar repousar 20 minutos à temperatura ambiente e ler a D.O. a 540nm.
Curva-padrão: 0, 0,02 , 0,04 , 0,06 , 0,08 e 0,10 m M de D-ribulose-o-nitrofenilhidrazona (a 1 m M/ml) diluída em HCL 0,1N

2ª aula

Análise dos resultados

MEIOS DE CULTURA

Meio C sólido

Sais CX10 100ml
MgSO4 0,1M 5ml
MnSO4 0,1M 1ml
Citrato de amónio férrico 7mM 10ml
Agar 1,7% q.b. para 1000ml

Sais CX10

K2HPO4 120g
KH2PO4 40g
(NH4)2SO4 30g
H2O q.b. para 1000ml

Adição de requerimentos aos meios:
aminoácidos - 20µg/ml em meios mínimos sólidos e 50µg/ml em meios mínimos líquidos

BIBLIOGRAFIA

Dische, Z. and Borenfreund, E. (1951). A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto sugars and trioses. The J. of Biol. Chemistry, 192:583-587.

Inácio, J.M., Costa, C. & Sá-Nogueira, I. (2003). Distinct molecular mechanisms involved in carbon catabolite repression of the arabinose regulon in Bacillus subtilis. Microbiol., 149, 2345-2355.

Isabel de Sá Nogueira (1985). Estudo de mutantes constitutivos para a utilização da L-arabinose em Bacillus subtilis. Relatório de Estágio, FCUL.

Maria Helena Paveia (1986). Genes de Bacillus subtilis para utilização da L-arabinose. Tese de Doutoramento, UL.

Mota, L.J., Tavares, P. & Sá-Nogueira, I. (1999). Mode of action of AraR, the Key regulator of L-arabinose metabolism in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol., 33, 476-489.

Mota, L.J., Sarmento, L.M. & Sá-Nogueira, I. (2001). Control of the Arabinose Regulon in Bacillus subtilis by AraR in vivo: Crucial Roles of Operators, Cooperativity and DNA looping. J. of Bacteriol., 183, 4190-4201.

Paveia, H. and Archer, L. (1992). Genes for L-arabinose utilization in Bacillus subtilis. Broteria Genetica, 13:149-159.

Paveia, H. and Archer, L. (1992). Mapping of ara genes in Bacillus subtilis. Broteria Genetica, 13:161-167.

Raposo, M.P., Inácio, J.M., Mota, L.J & Sá-Nogueira, I. (2004). Transcriptional regulation of Genes encoding Arabinan-Degrading Enzymes in Bacillus subtilis. J. of Bacteriol., 186: 1287-1296.

Sá-Nogueira, I., Paveia, H. and de Lencastre, H. (1988). Isolation of constitutive mutants for L-arabinose utilization in Bacillus subtilis. J. of Bacteriol., 170: 2855-2857.

Sá-Nogueira, I. and de Lencastre, H. (1989). Cloning and characterization of araA, araB and araD, the structural genes for L-arabinose utilization in Bacillus subtilis. J. of Bacteriol., 171: 4088-4091.

Sá-Nogueira, I. and Mota, L.J. (1997). Negative regulation of L-arabinose metabolism in Bacillus subtilis: characterization of the araR (araC) gene. J. of Bacteriol., 179: 1598-1608.

Sá-Nogueira, I., Nogueira, T., Soares, S. and de Lencastre, H. (1997). The Bacillus subtilis L-arabinose (ara) operon: nucleotide sequence, genetic organization and expression. Microbiology, 143: 957-969.

Sandra Ramos (1996). Clonagem e sequenciação completa do gene araE envolvido na utilização da L-arabinose de Bacillus subtilis. Relatório de Estágio, FCUL.

3ª aula

 

Extracção de DNA total de Bacillus subtilis

 

As células da estirpe de Bacillus subtilis 168 T + são inoculadas de véspera em 10ml de LB e deixadas a incubar a 37ºC, com agitação, até ao dia seguinte.

 

1. Recolher as células por centrifugação a 14 000 rpm, 10 min, à temperatura ambiente, num tubo eppendorf de 2ml;

2. Ressuspender o sedimento em 200 m l de TEG suplementado com 2mg/ml de lisozima e incubar a 37ºC, 10 a 20 min., sem agitação.

3. Promover a lise celular adicionando 600 m l de GES- b . Homogeneizar por inversão.

4. Adicionar 800 ml de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Homogeneizar por inversão (10X) e centrifugar 10 min., a 14 000rpm. Recolher a fase aquosa para novo tubo.

5. Repetir a extracção (se necessário, repetir segunda vez).

6. Transferir a camada superior (aquosa) para um novo tubo e adicionar igual volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Homogeneizar por inversão e centrifugar (ver 4.).

7. Transferir a camada aquosa para um novo tubo e precipitar o DNA adicionando 0,8 volumes de isopropanol. Centrifugar durante 5 minutos nas mesmas cndições.

8. Lavar o precipitado com 1ml de etanol 70% e secar a 37ºC. Ressuspender em 50 m l de TE suplementado com RNAse (20 m g/ml).

 

 

4ª aula

Transformação

Estirpe dadora:      Bacillus subtilis 168 T+

Estirpe receptora:      Bacillus subtilis BR 151 met B10 lys 3 trp C2

 

A(s) estirpe(s) receptora(s) é(são) inoculada(s), a partir de uma cultura fresca, em 10ml de GM 1 , suplementado com os requerimentos necessários, e incubada(s) a 37ºC com agitação, durante a noite.

•  Diluir a cultura 1:10 em meio GM 2 com os requerimentos necessários para crescimento da estirpe e continuar a incubação nas mesmas condições durante uma hora.

•  Adicionar, por cada ml de cultura a transformar, 0,2ml de MgSO 4 0,1M e 10 m l de DNA da estirpe dadora; efectuar um tubo controlo, sem adição de DNA.

Incubar a cultura nas mesmas condições durante 30 minutos.

•  Centrifugar a cultura um minuto, na mini-centrífuga, e ressuspender o sedimento no mesmo volume de líquido de diluição (sem requerimentos).

•  Semear, em duplicado, 100 m l das diluições 10 0 do controlo e das diluições 10 0 e 10 -1 da cultura transformada, em caixas de meio mínimo (meio C) com os suplementos necessários para análise de transformação para cada uma das marcas da estirpe receptora

•  Inocular a diluição 10 -5 da cultura transformada em meio completo (TBAB).

•  Incubar as caixas, em posição invertida, na estufa a 37ºC, durante 48h.

•  Após dois dias de incubação contar as colónias nos diferentes meios e fazer caixas-mãe dos transformantes (por palitagem) em meio completo (LB ou BHI sólido), de 50 colónias por caixa.

 

5ª aula

Análise de resultados

 

  1. Fazer réplicas para caixas de meio mínimo suplementado de forma a verificar a existência de cotransformação para duas e para três marcas. Analisar os resultados 48h depois.
  2. Calcular as percentagens de transformação e de cotransformação para as diferentes marcas.

MEIOS DE CULTURA

 

GM 1

 

  Sais SP x 10         10,0ml

  MgSO 4 0,1M         0,8ml

  Glucose a 20%         2,5ml

  Extracto de Levedura a 10%     1,0ml

  Caseína hidrolisada a 10%       0,8ml

  H 2 O       q.b. para 100,0ml

  

GM 2   

 

  GM 1         10,00ml

  CaCl 2 , 0,01M       0,25ml

  MgCl 2 , 0,1M       0,25ml

 

SP10

    K 2 HPO 4   140g

    KH 2 PO 4   60g

    (NH 4 ) 2 SO 4   20g

    Citrato trissódico   10g

    H 2 O   q.b. para 1000ml

 

SP1     Sais SP10 diluídos 1:10 em água desmineralizada estéril

 

SMA

    SP10   100ml

    MgSO 4 0,1M   8ml

    Glucose a 20%   25ml

    Caseína a 10%   0,5ml

    Agar a 1,7%   q.b. para 1000ml

 

PAB e NA    Preparar segundo as especificações da embalagem

 

Tampão de lise GES- b

  5 M Guanidina tiocinato

  100 mM   EDTA pH 8,0

  0,5% (v/v) sarcosil

  0,1% (v/v) b -mercaptoetanol

 

TE (10X)

  

  Tris         12,10 g

  EDTA         3,72 g

  H2O       q.b. para    1000 ml

  Ajustar o pH a 8, com HCl

  

TEG

  Tampão TE suplementado com 50mM de glucose

 

Adição de requerimentos aos meios:

aminoácidos   - 20 m g/ml em meios mínimos sólidos

        - 50 m g/ml em meios mínimos líquidos

          

 

 


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